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Minerva Medica 2013 October;104(5):519-25

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lingua: Inglese

Isolamento di cellule staminali mesenchimali di midollo osseo di coniglio mediante centrifugazione in gradiente di densità e metodi di screening dell’aderenza

Xia C. S., Zuo A. J., Wang C. Y., Wang Y. Z. ✉

Department of Orthopedics, The Affiliated Hospital of Medical College Qingdao University, Qingdao, China

Obiettivo. In condizioni particolari, le cellule staminali mesenchimali di midollo osseo (bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSC) possono differenziarsi in osteoblasti e condroblasti. Tuttavia, il numero di cellule staminali mesenchimali (mesenchymal stem cells, MSC) nel midollo osseo è basso. La coltivazione, purificazione e rapida proliferazione in vitro è alla base dell’applicazione delle tecniche di ingegneria tissutale. Obiettivo del presente studio è stato quello di ottimizzare, raccogliere, purificare e valutare le BMMSC di coniglio per osservarne il carattere biologico.
Metodi. Due conigli neozelandesi di sesso femminile di 2 mesi di età sono stati utilizzati per la raccolta delle MSC e la coltura cellulare primaria. La soluzione di midollo osseo è stata purificata mediante centrifugazione in gradiente di densità e il metodo di screening dell’aderenza. È stata ottenuta una soluzione di coltura. Le BMMSC sono state incubate in una soluzione di tampone fosfato (PBS), con l’aggiunta di 2,5 g/l di tripsina (3,0 ml), e sono state collocate in un incubatore a 37 °C per due o tre minuti. La morfologia cellulare è stata osservata utilizzando un microscopio invertito. La digestione è stata interrotta alla comparsa del recupero citoplasmatico, di cellule lunghe e sottili con ampio spazio intercellulare e di poche cellule rotonde. Successivamente, le BMMSC sono state incubate in L-DMEM privo di siero e collocate in una fiasca per coltura in plastica a 1,0x108/l. Sono stati ottenuti la morfologia delle MSC, la loro ultrastruttura e i marcatori di superficie, oltre alla proliferazione del primo, terzo, quinto, ottavo e decimo passaggio delle BMMSC e alla curva di crescita cellulare. Le BMMSC sono state purificate mediante centrifugazione in gradiente di densità e il metodo di screening dell’aderenza. Il terzo e quinto passaggio delle cellule presentavano una tipica forma a vortice.
Risultati e conclusione. Il microscopio elettronico a trasmissione ha dimostrato che le MSC rotonde od ovali possedevano ampi nuclei, con un’elevata percentuale nucleica e pochi organuli cellulari. Si trattava di cellule poco differenziate. La curva di crescita delle MSC in coltura presentava una forma a “S”. Le cellule del primo, terzo e quinto passaggio possedevano una forte capacità riproduttiva. L’ottavo e il decimo passaggio delle cellule presentavano una proliferazione significativamente ridotta. Le cellule isolate erano positive per CD44 e CD90 ma negative per CD34. Si trattava di cellule poco differenziate sotto il microscopio elettronico. Le cellule isolate sono MSC, con la proprietà di essere cellule staminali. Le cellule del primo e quinto passaggio sono pure, con una forte capacità riproduttiva.