ARTICOLO ORIGINALE   

La Rivista Italiana della Medicina di Laboratorio 2022 Giugno;18(2):102-7

DOI: 10.23736/S1825-859X.22.00145-1

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lingua: Italiano

Diagnostica molecolare di precisione: un’unica strategia per rilevare SARS-CoV-2 e il lineage B.1.1.7

Giovanni TRINCHESE ✉, Maria C. DI MARTINO, Angela SARAIELLO

U.O.C. Patologia Clinica, P.O. S. Maria della Pietà, Nola, Napoli, Italia

PREMESSE: Fin dall’esordio della pandemia da COVID-19 la diffusione di nuove varianti è la principale preoccupazione degli scienziati, pertanto sono necessarie metodiche analitiche in grado di rilevare la presenza del materiale genetico in modo rapido ed efficace per poterne controllare al meglio la diffusione. Nel mese di settembre del 2020 l’incremento di risultati falsi negativi, dovuti all’incapacità del test TaqPath COVID-19 RT-PCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) di rilevare il gene S in campioni positivi a SARS-CoV-2, a causa della delezione genomica 21765-21770 (fenomeno noto come drop out del gene S), ha permesso di valutare indirettamente la presenza di una nuova variante definita lineage B.1.1.7. Questa nuova casuale evidenza emersa per l’incapacità analitica della sonda target per il gene S, insieme all’implementazione di un nuovo kit di amplificazione Allplex™ SARS-CoV-2 Assay, ha spinto il nostro gruppo di lavoro del settore di Virologia della U.O.C. di Patologia Clinica del P.O. di Nola a ricercare una possibile relazione tra modifiche nel profilo di fluorescenza della curva del gene S e presenza di varianti di SARS-CoV-2.
METODI: L’RNA virale dei campioni è stato estratto tramite sistema automatizzato Seegene STARlet con l’utilizzo del kit StarMag 96x4 Viral DNA/RNA 200C. Tutti i campioni sono stati sottoposti a Real Time RT-PCR con il kit di amplificazione Allplex™ SARS-CoV-2 Assay (Seegene Inc, Seul, Corea del Sud) per la rilevazione qualitativa di quattro geni target: gene E, geni S/RdRP e gene N. I campioni risultati positivi per il genoma virale di SARS-CoV-2 con anomalie nella forma sigmoidale della curva di amplificazione dei geni RdRP/S sono stati sottoposti ad ulteriori indagini per verificare la presenza del lineage B.1.1.7 tramite il kit di amplificazione GSD NovaTYpe SARS-CoV-2 (Nova Tec Immunodiagnostica, Dietzenbach, Hessen, Germany) e a sequenziamento con Next Generation Sequencing (NGS).
RISULTATI: Allplex™ SARS-CoV-2 Assay ha messo in evidenza una riduzione dell’efficienza dell’amplificazione nel profilo di fluorescenza dei geni S/RdRP con modifiche nella pendenza e punti di inflessione in trenta campioni pervenuti in laboratorio nel mese di gennaio 2021. La conferma della variante inglese è stata effettuata tramite test qualitativo in RT-PCR (GSD NovaTYpe SARS-CoV-2) e, successivamente, con tecnologia NGS (eseguito presso un Laboratorio esterno). Entrambe le metodiche analitiche hanno identificato il lineage B.1.1.7. di SARS-CoV-2 per tutti i trenta campioni analizzati. Quest’ultima conferma diagnostica ha spinto il nostro gruppo di lavoro a valutare la presenza e il grado di diffusione della variante inglese nel bacino di utenza dell’ASL Napoli 3 Sud. L’analisi di 900 campioni positivi a RT-PCR (Allplex™ SARS-CoV-2), con alterazioni del profilo di fluorescenza della curva di amplificazione relativa ai geni RdRP/S, tramite kit GSD Nova Type SARS CoV-2 è servita a verificare l’effettiva presenza del lineage B.1.1.7, dato confermato nel 94,7% dei campioni testati.
CONCLUSIONI: I dati emersi confermano che il kit Allplex™ SARS-CoV-2 ha contribuito in modo efficace, con una riduzione sia nei tempi che nei costi, ad un primo screening per la presenza di varianti del virus SARS-CoV-2 già in fase di analisi in Real Time PCR. Ciò ha consentito di individuare i soggetti portatori di varianti del virus ancora prima del sequenziamento del genoma virale e di constatare l’effettiva predominanza della variante inglese nel territorio di competenza dell’ASL Napoli 3 Sud nel periodo gennaio-marzo 2021.

KEY WORDS: SARS-CoV-2 variants; SARS-CoV-2; Clinical laboratory techniques