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GIORNALE ITALIANO DI DERMATOLOGIA E VENEREOLOGIA

Rivista di Dermatologia e Malattie Sessualmente Trasmesse


Official Journal of the Italian Society of Dermatology and Sexually Transmitted Diseases
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Giornale Italiano di Dermatologia e Venereologia 2005 October;140(5):475-83

Copyright © 2005 EDIZIONI MINERVA MEDICA

lingua: Inglese

Profilo dell’espressione genica nei cheratinociti dei pazienti affetti da dermatite atopica

Pastore S. 1, Rogge L. 2, Mariotti F. 1, Mascia F. 1, La Scaleia R. 1, Dattilo C. 1, Sinigaglia F. 3, Girolomoni G. 4

1 Laboratory of Biochemistry Istituto Dermopatico dell'Immacolata, Roma, Italy
2 Laboratory of Immunoregulation Department of Immunology, Institut Pasteur, Paris, France
3 BioXell SpA, Milano, Italy
4 Unit of Dermatology, Department of Biomedical and Surgical Sciences, University of Verona, Verona, Italy


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Obiettivo. I cheratinociti di pazienti con dermatite atopica presentano una spiccata tendenza a rilasciare livelli elevati di alcune citochine e chemochine, che, pertanto, possono giocare un ruolo importante nella promozione e nel mantenimento dell’infiammazione. Inoltre, questo meccanismo molecolare può essere implicato nella localizzazione cutanea della sindrome atopica. La conoscenza del profilo quali-quantitativo dei trascritti genici attraverso la tecnologia dei chip oligonucleotidici in una popolazione cellulare pura può aiutare a individuare quali processi molecolari sono attivi in vivo. Questa tecnologia è basata sull’ibridazione del RNA complementare opportunamente marcato con oligonucleotidi specifici per migliaia di trascritti, i quali sono fissati su un chip di silicone idoneo alla successiva analisi computerizzata del risultato. Partendo dall’RNA totale estratto da colture non stimolate di cheratinociti abbiamo ricavato il profilo dei trascritti differenzialmente espressi tramite analisi con chip di oligonucleotidi.
Metodi. Nello studio sono stati arruolati 6 pazienti, con un’età compresa tra i 19 e i 45 anni, affetti da dermatite atopica da lieve a severa. Sei volontari sani, di età compresa tra i 25 e i 50 anni, sono stati usati come gruppo di controllo.
Risultati. I livelli relativi di espressione della maggior parte dei 201 trascritti differenzialmente espressi sono risultati globalmente piuttosto bassi (inferiori a 5 000 U di assorbanza) sia nei cheratinociti di controllo sia in quelli provenienti da soggetti atopici, a sottolineare il fatto che le colture sono state esaminate in condizioni basali, ovvero in assenza di stimolazione. Tra questi, si sono individuati trascritti codificanti per fattori di trascrizione, secondi messaggeri, regolatori del ciclo cellulare ed enzimi coinvolti nella risposta infiammatoria dei cheratinociti. Al fine di verificare i dati ottenuti dai chip di oligonucleotidi, si è impiegata una tecnica indipendente di analisi quantitativa dei livelli di trascritto, ovvero la real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) basata sull’impiego dell’intercalante SYBR Green. A questo scopo, si sono impiegate almeno 2 coppie di primer per la quantizzazione accurata di ogni singolo trascritto. Quest’analisi è stata applicata a 10 diversi trascritti appartenenti ai diversi gruppi funzionali individuati, alcuni dei quali erano risultati sovra-espressi o sotto-espressi nei cheratinociti di pazienti con dermatite atopica in base all’analisi dei chip di oligonucleotidi. I dati forniti dalla real-time RT-PCR sono risultati in parte non sovrapponibili a quelli ottenuti con i chip di oligonucleotidi. In particolare, l’espressione dei trascritti per la metalloprotease (MMP)-2 e per la leupaxina, proteina associata alle focal adhesion kinases, non è parsa differenzialmente espressa tra i 2 gruppi di donatori. Inoltre, il fattore di trascrizione SAP1b non è risultato sovra-espresso, ma piuttosto sotto-espresso nei cheratinociti da pazienti con dermatite atopica. Trascritti per l’oncosoppressore PISSLRE (proteina cdc2-simile) e per l’enzima 15-lipoossigenasi (15-LO), implicato nella generazione dei leucotrieni, sono risultati talmente poco rappresentati da essere sotto il limite di sensibilità della tecnica in tutti i soggetti esaminati. Infine, è risultata importante la variabilità interindividuale dell’espressione dei trascritti specifici per il fattore di trascrizione c-fos, per la sfingomielinase acida (SMPD1), per la protein fosfatasi 2A (PP2A) e per la proteina regolatoria della GTP cicloidrolasi. Solo il trascritto per la cistein proteasi catepsina O è risultato omogeneamente più espresso in tutti i cheratinociti di pazienti con dermatite atopica.
Conclusioni. Globalmente, i dati raccolti indicano che l’esiguo numero dei donatori e i bassi livelli di espressione genica caratteristici della condizione di coltura basale possono seriamente inficiare l’utilità di una tecnologia fine come quella dei chip di oligonucleotidi nella definizione del profilo di espressione genica. Inoltre, l’esistenza di importanti differenze interindividuali nell’espressione di alcuni geni (c-fos, PP2A) indica la complessità dell’identificazione delle basi molecolari

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